簡介：
隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展,，越來越多的不孕不育夫婦通過行體外受精－胚胎移植（IVF-ET）成功孕育下一代。作為丈夫取出優(yōu)質(zhì)的精子很重要，然而,，在接受輔助生殖技術(shù)助孕的患者中，一些患者由于精神壓力,、心理因素,、取精環(huán)境等各種原因?qū)е氯【 Ｈ【⒅苯訉?dǎo)致取卵移植手術(shù)取消,。本研究對IVF-ET過程中可能出現(xiàn)取精困難的患者在取卵前提前進(jìn)行精液冷凍,，并與取卵當(dāng)天成功取出新鮮精液的患者的胚胎情況進(jìn)行比較，以評價(jià)提前冷凍精液在取精困難患者中的可行性及對妊娠結(jié)局的影響,。
資料與方法
１．１一般資料：
回顧性分析2018年１月至2019年１２月進(jìn)入體外受精（IVF）周期取精困難男性患者７０例及其配偶,。男方納入標(biāo)準(zhǔn)：１）既往有取精困難史或取精失敗者；２）取卵日前曾順利取過精液,，且有精子,；３）無不射精病史或逆行射精；４）卵泡刺激素（FSH）,、黃體生成素（LH）,、催乳激素（PRL）、雌激素（E）、雄激素（T）正常,。
夫婦雙方均自愿簽署知情同意書并且男方均提前冷凍精液,。女方納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)規(guī)律正常，子宮卵巢形態(tài)正常,，促排方案均采用促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）超長方案,。其中男、女方年齡分別為（34.73±5.48）歲和（31.91±3.44）歲,，不孕年限（3.31±1.83）年,，女方BMI（21.57±1.83）ｋｇ／ｍ２。
70例中取卵日重新獲取新鮮精液40例（新鮮組）,，取卵日取精失敗使用冷凍精液30例（冷凍組）,。兩組間的年齡、不孕年限,、女方ＢＭＩ,、移植胚胎數(shù)、平均獲卵數(shù)等基本資料對比,，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0.05,，表１）。
１．２方法：
１．２．１ＧｎＲＨ－ａ超長方案：女方于月經(jīng)周期第２～５天肌內(nèi)注射或皮下注射長效藥物進(jìn)行降調(diào)節(jié),。Ｂ超監(jiān)測卵泡發(fā)育,，卵泡≥18ｍｍ時(shí)，肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG）10000Ｕ,。注射后３６ｈ行Ｂ超引導(dǎo)經(jīng)陰道取卵術(shù),。
１．２．２精液冷凍、解凍及優(yōu)化處理：按照《ＷＨＯ人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第５版,，利用超低溫冷凍技術(shù)冷凍精液,。冷凍方法為液氮熏蒸法：室溫下操作，用一次性無菌吸管按照等體積加入精子冷凍液,，逐滴加入,；邊加邊輕柔搖晃取精杯，使之充分混勻,；加完后,，準(zhǔn)備好精子冷凍管，一般為1.8ｍＬ／管,，加入精液和精子冷凍液的混合液體,，于液氮面上熏蒸，最后投入液氮罐,。解凍方法：37℃水浴箱20ｍｉｎ,；涂片顯微鏡檢查,；根據(jù)解凍后的精液濃度及前向活動率行IVF，解凍后濃度活力不足IVF的,，需行卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）助孕治療,。IVF精液優(yōu)化處理為梯度離心加上游法。
１．３觀察指標(biāo)：
１）囊胚評分：16-20ｈ后觀察精卵結(jié)合情況,，正常受精后進(jìn)行卵裂期胚胎和囊胚期的囊胚評分，具體的胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)參照《人類體外受精胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識（2016）》,。正常受精率＝雙原核（２PN）受精數(shù)／獲卵數(shù)×100％,。卵裂率＝受精卵裂數(shù)／雙原核受精數(shù)×100％。優(yōu)質(zhì)胚胎率＝優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／雙原核受精卵裂數(shù)×100％,。囊胚形成率＝形成囊胚數(shù)／囊胚培養(yǎng)數(shù)×100％,。
２）臨床妊娠：移植14ｄ后，查血HCG確認(rèn)妊娠,；第３５天Ｂ超,，可見到孕囊及心管搏動確定為臨床妊娠。妊娠率＝妊娠周期數(shù)／移植周期數(shù)×100％,。
１．４統(tǒng)計(jì)方法：
采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),。年齡、不孕年限,、女方ＢＭＩ,、移植胚胎數(shù)、平均獲卵數(shù)采用ｘ±ｓ表示,，兩組間比較采用兩樣本ｔ檢驗(yàn),；正常受精率、卵裂率,、優(yōu)質(zhì)胚胎率,、囊胚形成率和臨床妊娠率采用χ２檢驗(yàn)。Ｐ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。
結(jié)果
兩組間的正常受精率,、卵裂率、囊胚形成率,、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0.05）,，見表２。
討論
在接受輔助生殖技術(shù)過程中,，取精困難是不可避免的意外情況,。針對取精困難，干預(yù)措施較多,，比如睪丸或附睪穿刺取精,、卵子玻璃化冷凍技術(shù)。通過睪丸或附睪取出的精子量少，不足以IVF,，必須改行ICSI,，這樣不僅會改變患者的授精方式，而且與常規(guī)IVF相比,，ICSI是否能夠提高胚胎質(zhì)量,，是否能夠獲得更好的臨床結(jié)局尚無定論。
有研究認(rèn)為ICSI既不能改善胚胎質(zhì)量,，也不能改善臨床結(jié)局,，并且ICSI可能存在安全隱患，會對胚胎造成負(fù)面影響,。同時(shí),，進(jìn)行ICSI技術(shù)所需要的精力和費(fèi)用也更多。盡管國內(nèi)有研究表明,，卵子玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖中具有較好效果,，有助于保存女性生育能力；但是由于卵子細(xì)胞大,、體表面積與體積比小,、含水分多、卵子的紡錘體及其他細(xì)胞器對溫度敏感等因素,，使得這項(xiàng)技術(shù)難以普及,。
目前精子冷凍技術(shù)比較成熟，患者容易接受,，因此本中心把提前冷凍精液作為優(yōu)先采取的措施,。患者提前冷凍精液時(shí),，取精環(huán)境更加安靜,，取精時(shí)間更加充裕，因此患者成功取出精液的概率更高,。不少患者就因?yàn)橛辛恕皟鼍弊鳛楸５椎男睦戆凳?，于女方取卵日順利取出精液。但是,，對于冷凍精子是否會對胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局造成影響,，一直是臨床最為關(guān)心的問題。本文結(jié)果顯示,，兩組間的正常受精率,、卵裂率、囊胚形成率,、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,，這說明精液冷凍可能不會影響胚胎的質(zhì)量,，并且不會影響妊娠結(jié)局。
這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致,。這主要是因?yàn)?，在精液冷凍過程中，精子通過精液冷凍液的脫水作用能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的水分幾乎完全置換到細(xì)胞外,，細(xì)胞在－196℃的液氮中冷凍時(shí),，剩余的水分不易造成大冰晶，所以不會損傷精子的微絲微管,；精子在復(fù)蘇后,，完整的精子可以順利完成精卵結(jié)合。有研究報(bào)道,，冷凍精子復(fù)蘇后會增加精子的ＤＮＡ損傷，影響精子的ＤＮＡ碎片率,。精子ＤＮＡ碎片率升高,，正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率,、囊胚形成率和妊娠率會降低,。
但是，卵子和胚胎對ＤＮＡ具有一定的修復(fù)能力,，其中胚胎對精子ＤＮＡ損傷修復(fù)能力的大小與母系基因的完整性和卵子的質(zhì)量密切相關(guān),。有學(xué)者認(rèn)為，對于精子ＤＮＡ碎片率較高以及嚴(yán)重少,、弱,、畸形精子癥的標(biāo)本，采用密度梯度離心法能夠收集形態(tài)正常和活力較好的精子,。本文中冷凍組和新鮮組的精液均采用密度梯度離心加上游法處理,，處理后濃度及活力均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。
綜上所述,，預(yù)知取卵日可能會取精失敗的患者可提前冷凍精液,，這種辦法是可行的，并且不會影響胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局,。當(dāng)然,，體外受精－胚胎移植治療中，應(yīng)做好足夠的應(yīng)對措施,，盡量避免因取卵日男方無法提供足夠精子而選擇卵子冷凍,。
